阿魏酸哌嗪对阿霉素肾病大鼠肾脏保护作用的探讨
       阿魏酸哌嗪系根据传统中药川芎的有效成份阿魏酸经化学方法合成的药物。既往的研究表明该药具有抗凝、扩张血管、抑制ADP诱导的血小板聚集等作用，许多临床研究表明阿魏酸哌嗪能减少蛋白尿，延缓肾功能减退，但其作用机理尚不清楚。因此本研究旨在观察阿魏酸哌嗪对阿霉素肾病大鼠肾病的保护作用，并初步探讨其可能的作用原理。
　　材料与方法
　　1、实验动物 成年雄性SD大鼠24只，体重200-220g（购自上海中国科学院实验动物中心），随机分为正常对照组（NC组）和肾病模式型组。肾病组予以 0.1 %阿霉素（深圳万乐药业有限公司）7.5mg/kg经尾静脉注射。正常对照组给予等量生理盐水尾静脉注射。注射后1周肾病组尿蛋白质？ ，模型成立。随后将肾病组大鼠再随机分为3组。阿魏酸哌嗪组（NS-P组）：给予阿魏酸哌嗪（成都亨达制药厂）50mg·kg-1·d-1灌胃；福辛普利组（NS-F组）：给予福辛普利（上海施贵宝制药有限公司）25 mg·kg-1·d-1灌胃；肾病未治疗组（NS组）：每组大鼠均为6只，正常对照组和肾病综合征未治疗组大鼠每天予以等量自来水灌胃。所有动物饲养于复旦大学医学院实验动物中心，自由饮水和进食，8周后处死，处死前1d，所有大鼠置于代谢笼中收集24h小便。
　　2、实验方法
　　2．1 生化测定 采用日立7170A型自动生化分析仪测定24h尿蛋白、血尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、胆固醇、甘油三酯。
　　2．2 肾脏病理学检查 所有标本按常规方法固定、脱水、包埋，切片厚4μm，行HE、PAS染色。PAS染色切片用北航医学图像分析系统进行分析，每张切片在20倍目镜下随机取20个完整肾小球，计算肾小球基质与肾小球面积之比，此值即为肾小球基质相对面积。
　　2．3 免疫组化 采用Envision法检测肾组织中的纤维连接蛋白（FN）、IV型胶原（Col IV）、转化生长因子β1（TGF-β1）、内皮素（ET-1）。用PAP法检测PAI-I。羊PAP1：200（DAKO公司）37℃60min，DAB显色。以删除第一抗体的方法作为阴性对照。每张切片在同一条件下随机取20个视野，采用北航医学图像管理系统进行分析，得出阳性目标面密度和阳性单位，计算两项指标的乘积。
　　2．4 RT-PCR 所有标本均采用Etlzol（Gibco）试剂一步法抽提总RNA，再逆转录成Cdna(Promcga逆转录试剂盒)以适量cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶催化下行PCR，根据Genebank内的序列，采用Primc3设计引物，由中国科学院上海细胞生物研究所合成。GAPDH的引物为：正链：5-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3；负链：5-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3；扩增条件：94℃，3min，94℃，30s，60℃，30s，72℃，30so共30个循环，最后72℃延伸？0min，终产物308bp；PAI-1的引物序列为：正链5-TGA GAT CAG TAC TGC GGA CG-3；负链：5-GAG GGG CAC ATC TTT TTC AA-3；扩增条件为95℃，3min；94℃，40s；56v，45s，72℃，60s，共循环35圈，最后72℃，延伸20min。终产物为499bp；TGF-β1的引物为：正链：5-GGA CTA CTA CGC CAA AGA AG-3；负链：5-TCA AAA CAC AGC CAC TCA GG-3；扩增条件：95℃，3min，95℃，40s，55℃，60s，72℃，30s共循30圈，最后72℃，延伸10min，终产物为294bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，再用BIORAD凝胶成像分析系统进行分析，以待测指标与GAPDH吸光度的比值来表示其相对含量。
　　3、统计学方法 计量数据用（x±s）表示，组间比较采用方差分析，用SPSS统计软件进行分析，P＜0.05为有统计学意义。
　　结　　果
　　1、尿蛋白及生化指标 与正常对照组相比，肾病组大鼠24h尿蛋白排出量明显增加，有显著性差异，P＜0.01。阿魏酸哌嗪和福辛普利治疗8周后，尿蛋白均明显下降，与NS组相比有显著性差异，P＜0.01，两治疗组相比，F组低于P组，但无统计学意义。两治疗组对BUN均无影响，血肌酐在阿魏酸治疗组下降，P＜0.05，见表I。血浆白蛋白、总蛋白与NC组相比，肾病组明显下降，P＜0.01，与NS组相比，P和F组明显升高，但尚未达到正常组水平。与NC组相比，肾病大鼠胆固醇和甘油三酯明显升高，阿魏酸哌嗪对胆固醇无明显影响，而甘油三酯明显降低，与NS组相比有显著性差异P＜0.01，见表2
　　2、肾组织病理变化 光镜下、肾病大鼠可见肾小球空泡变性，系膜外基质增多，偶见局灶节段性硬化，肾小管管腔内大量蛋白管型。阿魏酸哌嗪和福辛普利治疗后与NS组比较，上述改变明显减轻，F组与P组相比，F组更为明显，PAS染色中基质与肾小球面积之比显示，药物治疗组明显低于NS组，有显著性差异P＜0.05，见图1。
　　表１　各组大鼠尿蛋白及肾功能

组别

尿蛋白（mg/d）

尿素氮（mmol/L）

血肌酐（μmol/L）

NC

18.2±0.9

6.2±0.6

26.7±4.5

NS

130±18.47

13.8±1.5

31.6±3.2

P

69.50±27.25△△

12.6±1.8

23.1±2.1△

F

54.83±17.33△△

12.1±0.5

35±2.1

　　注：与NC组比较，P＜0.01，与NS组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

　　表２　各组大鼠血脂及血浆蛋白

组别

血白蛋白

血总蛋白

胆固醇

甘油三酯

NC

25.87±0.99

55.50±3.07

1.5±0.2

0.36±0.07

NS

14.75±2.06

42.33±5.81

15.2±4.7

13.5±4.2

P

17.5±1.38

46.00±2.00

14.6±3.7

2.5±4.7

F

19.5±2.23

47.55±4.91

16.4±5.3

12.5±6.2

　　3、免疫组化分析  免疫组化显示，在肾病组大鼠，肾小球FN、IV型胶原均高于正常对照组，阿魏酸哌嗪、福辛普利治疗后使其减少。肾病组的TGF-β1、PAI-1和ET-1表达增加。治疗后明显下降，阿魏酸哌嗪对ET-1的抑制作用较福辛普利更为明显。

　　表３　各组大鼠免疫组化指标

组别

TGF-β1

PAI-1

FN

CoIIV

ET-1

NC

0.119±0.004

0.191±0.109

0.525±0.146

0.069±0.070

0.468±0.139

NS

0.811±0.026

1.827±0.466

1.354±0.576

0.589±0.478

0.691±0.228

P

0.425±0.139

0.941±0.009

0.818±0.325

0.229±0.122

0.352±0.065

F

0.417±0.104

0.787±0.009

0.803±0.202

0.272±0.035

0.445±0.241

　　4、分子生物学  RT-PCR显示，肾病组大鼠TGF-β1mRNA和PAI-1mRNA表达明显高于正常对照组，福辛普利和阿魏酸哌嗪均能使其明显下调，见表4

　　表４　各组大鼠TGF-β1mRNA和PAI-1mRNA表达的变化

组别

TGF-β1

PAI-1

NC

0.324±0.079

0.426±0.165

NS

0.786±0.112

0.942±0.169

P

0.468±0.161

0.655±0.202

F

0.431±0.156

0.581±0.199


　　讨论
　　一般认为，在阿霉素诱导的肾病模型中，早期主要是表现为大量蛋白尿等肾病综合征的表现，在后期可以出现细胞外基质聚集，导致肾小球硬化和间质纤维化，最终导致终末期肾病。有文献报道，在ADR肾病早期即可出现FN的合成增加。我们在本实验中发现，在成模后8周时可见肾小球系膜区ECM成分IV型胶原、FN等的表达明显增加，并有部分肾小球硬化的表现，而在应用福辛普利和阿魏酸哌嗪后肾脏的ECM如IV型胶原和FN等的表达远减少，提示两药均有抗肾小球硬化的作用。
　　目前有大量文献报道，TGF-β在肾脏病变发展过程中发挥了重要作用，TGF-β能促进细胞外基质合成，抑制细胞外基质降解，并促进整合素的表达。本实验中，在应用PF和Fosinopril后，TGF-β1mRNA表达明显下调，这可能是他们减轻肾脏病变的机理之一。Fosinopril是一种血管紧张素转化酶抑制剂，通过抑制血管紧张素转化酶来减少Angll的生成。而肾脏局部的血管紧张素II能直接刺激TGF-β1的产生，从而导致细胞外基质积聚，引起肾小球硬化和肾间质纤维化。ACEI可通过减少AngII的产生，进而下调TGF-β1,从而使细胞外基质的沉积减少，从而发挥肾脏保护作用。我们的实验也证实ACEI对病变大鼠肾脏有明显的保护作用。同时在PF组，我们发现TGF-β1也明显低于病变组，但我们未肾脏局部的AngII，故我们尚不明了PF是否也能干预肾脏局部的RAS系统，减少AngII,从而下调TGF-β1.这有待于进一步的实验研究。
　　在正常情况下，细胞外基质还可被许多蛋白酶所降解，其中纤溶酶（PA）可直接参与细胞外基质蛋白质成分如LN、FN的降解，而PAI-I可抑制PA对细胞外基质的降解，也可导至细胞外基质的积聚。而我们发现在应用PF后肾脏局部的PAI-I表达明显减少。提示PAI-I的表达下调可能也是阿魏酸哌嗪减轻肾脏损害的重要机制之一。
　　有大量文献表明，内皮素在许多肾脏疾病的发生及进展过程中发挥着重要作用。ET-1在肾脏局部以自分泌和旁分泌的方式发挥其生物作用，它既能影响肾血流动力学，又可刺激细胞过度增生，增加肾脏细胞纤维化和胶原的合成，有助于细胞外基质成分过度堆积。由于有文献报道，阿魏酸能够拮抗ET-1的缩血管和致血管平滑肌细胞增殖的效应，为一新的非肽类内皮素拮抗剂。另外的研究表明以阿魏酸为母体合成的阿魏酸化合物同样具有拮抗ET-1生物效应的作用。为明确阿魏酸哌嗪是否能干预内皮素系统，我们采用了免疫组化的方法检察了肾脏局部ET-1的表达，结果发现，在阿魏酸哌嗪组ET-1的表达明显低于成模组，提示阿魏酸哌嗪可能下调肾脏局部ET-1的表达。因此我们推测阿魏酸哌嗪拮抗ET-1的作用可能也是其保护肾脏的重要机理之一。
　　在本试验中我们还发现阿魏酸哌嗪能明显降低血浆甘油三酯水平，但其作用机理尚不清楚，有待于进一步的研究。由于在改善血脂后常能改善肾脏疾病的表现，故这可能也是阿魏酸哌嗪发挥肾脏保护作用的机理之一。
　　总之，在阿霉素肾口香糖模型中，阿魏酸哌嗪可能通过拮抗ET-1,下调TGF-β1和PAI-1的表达，进而发挥其肾脏保护作用，其详细的作用机理尚有待进一步的研究。
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